Зміст
- Клонування ДНК: визначення та огляд процесу
- Метод векторних плазмід
- Метод ПЛР (ланцюгова полімеразна реакція)
- Використання методів клонування ДНК плазмідного вектора та ПЛР разом
- Приклади клонування ДНК для біотехнології
- Приклади клонування ДНК для дослідження
- Приклади клонування ДНК для генної терапії
Можна клонувати цілі організми, такі як вівці Доллі, але клонування ДНК відрізняється. Для виготовлення використовується методи молекулярної біології однакові копії послідовностей ДНК або поодинокі гени.
За допомогою методів генної інженерії ідентифікуються та виділяються сегменти генетичного коду ДНК. Потім клонування ДНК копіює послідовності нуклеїнових кислот у сегменти.
Отримані однакові копії можуть бути використані для подальших досліджень або для застосування в біотехнології. Часто ген, який копіюється, кодує білок, який може входити до складу медикаментозного лікування. ДНК-технологія в тому числі Клонування ДНК підтримує розуміння того, як працюють гени та як генетичний код людини впливає на функціонування організму.
Клонування ДНК: визначення та огляд процесу
Клонування ДНК - це молекулярно-біологічний процес виготовлення однакових копій сегментів ДНК, розташованих у хромосомах, що містять генетичний код передових організмів.
Процес генерує великі кількості введення цільові послідовності ДНК. Метою клонування ДНК є отримання самих цільових послідовностей ДНК або отримання білків, закодованих у цільових послідовностях.
Називаються два методи, які використовуються при клонуванні ДНК вектор плазміди і полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). В вектор плазміди методом, нитки ДНК вирізають за допомогою рестрикційні ферменти для отримання фрагментів ДНК, і отримані сегменти вставляють у вектори клонування, звані плазмідами для подальшого дублювання. Плазміди поміщаються в бактеріальні клітини, які потім виробляють копії ДНК або кодують білки.
В ПЛР-метод, сегмент ланцюга ДНК, який слід дублювати, позначений ферментами під назвою ґрунтовки. Фермент полімерази робить копії позначеної частини ланцюга ДНК. Цей метод не використовує рестрикційні ферменти і може виробляти клоновану ДНК з невеликих зразків. Іноді два методи ДНК-технології використовуються разом, щоб включити найкращі характеристики кожного в загальну реакцію.
Метод векторних плазмід
Вектор способу відноситься до плазміди, яка використовується для утримування цільового сегмента ДНК, який буде клонований. Плазміди - це невеликі кругові пасма нехромосомна ДНК міститься у багатьох організмах, включаючи бактерії та віруси.
Бактеріальні плазміди є вектором, що використовується для вставки цільового сегмента ДНК у бактеріальні клітини для подальшого дублювання.
Вибір та виділення цільової ДНК: Перш ніж почати процес клонування ДНК, слід визначити послідовності ДНК, особливо початки та кінці сегментів ДНК.
Такі послідовності ДНК можна знайти, використовуючи існуючу клоновану ДНК з відомими послідовностями або шляхом вивчення білка, продукованого цільовою послідовністю ДНК. Як тільки послідовність відома, можна використовувати відповідні рестрикційні ферменти.
Розрізання цільової ДНК ферментами рестрикції: Рестрикційні ферменти підбираються для пошуку коду ДНК на початку та в кінці цільових послідовностей.
Коли рестрикційні ферменти знаходять спеціальну кодовану послідовність пар підстав, що називаються сайтами рестрикції, вони приєднуються до ДНК у цьому місці і обмотуються навколо молекули ДНК, відриваючи ланцюг. Розрізані сегменти ДНК, що містять цільову послідовність, тепер доступні для дублювання.
Вибір вектора плазміди та вставлення цільової ДНК: Відповідна плазміда в ідеалі містить ті ж послідовності кодування ДНК, що і ланцюг ДНК, з якої була вирізана цільова ДНК. Кругову ланцюг ДНК плазміди розрізають тими ж рестрикційними ферментами, що були використані для різання цільової ДНК.
А Фермент ДНК-лігази використовується для сприяння зв'язування сегмента ДНК, а кінці сегмента цільової ДНК зв'язуються з вирізаними кінцями плазмідної ДНК. Тепер цільова ДНК є частиною кругової ланцюга ДНК плазміди.
Вставлення плазміди в бактеріальну клітину: Після того, як плазміда містить послідовність ДНК, яку потрібно клонувати, фактичне клонування може відбуватися, використовуючи процес, який називається бактеріальна трансформація. Плазміди вставляють у клітину бактерій, таких як E. coli, і клітини з новими сегментами ДНК почнуть виробляти копії та відповідні білки.
При бактеріальній трансформації клітини-господарі та плазміди інкубують разом при температурі тіла протягом приблизно 12 годин. Клітини поглинають частину плазмід і розглядають їх як власну ДНК плазміди.
Збір клонованої ДНК та білків: Більшість плазмід, які використовуються для клонування ДНК, мають гени стійкості до антибіотиків включені в їх ДНК. Оскільки клітини бактерій поглинають нові плазміди, вони стають стійкими до антибіотиків.
Коли культуру обробляють антибіотиками, виживають лише ті клітини, які поглинули нові плазміди. В результаті отримують чисту культуру бактеріальних клітин з клонованою ДНК. Тоді ДНК може бути зібрана або відповідний білок.
Метод ПЛР (ланцюгова полімеразна реакція)
Метод ПЛР простіший і копіює наявну ДНК на місце. Для цього не потрібно розрізати рестрикційними ферментами або вставляти послідовності плазмідної ДНК. Це робить його особливо придатним для клонування зразків ДНК з обмеженою кількістю ланцюгів ДНК. Хоча метод може клонувати ДНК, він не може бути використаний для отримання відповідного білка.
Видалення ниток ДНК: ДНК у хромосомах щільно згорнута у структуру подвійної спіралі. Нагрівання ДНК до 96 градусів Цельсія в процесі, який називається денатурація змушує молекулу ДНК розмотуватися і розділятися на дві нитки. Цей поділ необхідний, оскільки одночасно може бути клонований лише один ланцюг ДНК.
Вибір праймерів: Як і у випадку клонування ДНК плазмідного вектора, послідовності ДНК, що підлягають клонуванню, повинні бути визначені з особливим акцентом на початку та кінці сегментів ДНК. Праймери - це ферменти, які приєднуються до певних кодових послідовностей ДНК, і їх потрібно вибирати для позначення цільових сегментів ДНК. Праві праймери прикріплять до послідовностей молекули ДНК для позначення початку та кінця цільових сегментів.
Відпал реакції на зв'язування праймерів: Викликається охолодження реакції приблизно до 55 градусів Цельсія відпал. Коли реакція охолоне, праймери активуються і приєднуються до ланцюга ДНК на кожному кінці цільового сегмента ДНК. Праймери діють лише як маркери, і ланцюжок ДНК не потрібно розрізати.
Отримання однакових копій цільового сегмента ДНК: У процесі, який називається розширення, в реакцію додають фермент TAQ-полімерази TAQ. Потім реакційну суміш нагрівають до 72 градусів Цельсія, активуючи фермент. Активний фермент ДНК-полімерази зв'язується з праймерами і копіює послідовність ДНК між ними. Початковий процес секвенування та клонування ДНК завершений.
Підвищення виходу клонованої ДНК: Початковий процес відпалу та розширення створює порівняно мало копій наявних сегментів нитки ДНК. Щоб збільшити вихід за рахунок додаткової реплікації ДНК, реакцію знову охолоджують, щоб повторно активувати праймери і дати їм зв'язуватися з іншими ланцюгами ДНК.
Потім повторне нагрівання реакції знову активує фермент полімерази і утворюється більше копій. Цей цикл можна повторити від 25 до 30 разів.
Використання методів клонування ДНК плазмідного вектора та ПЛР разом
Метод вектора плазміди спирається на достатню початкову подачу ДНК для вирізання та вставки у плазміди. Занадто мало оригінальної ДНК призводить до зменшення кількості плазмід і повільного початку клонування виробництва ДНК.
Метод ПЛР може отримати велику кількість ДНК з кількох оригінальних ниток ДНК, але оскільки ДНК не імплантується в бактеріальну клітину, виробництво білка неможливе.
Для отримання білка, закодованого в фрагментах ДНК, які будуть клоновані з невеликого початкового зразка ДНК, два способи можна використовувати разом, і вони можуть доповнюють один одного. Спочатку метод ПЛР використовується для клонування ДНК з невеликого зразка та отримання багатьох копій.
Потім продукти ПЛР використовують методом вектора плазміди для імплантації виробленої ДНК в бактеріальні клітини, які вироблять потрібний білок.
Приклади клонування ДНК для біотехнології
Молекулярна біологія використовує клонування генів та реплікацію ДНК в медичних та комерційних цілях. Бактерії з клонованими послідовностями ДНК використовуються для виробництва лікарських препаратів та заміщення речовин, які люди, які мають генетичні порушення, не можуть виробляти самі.
Типове використання включає:
Біотехнологія також використовує клонування генів у сільському господарстві для створення нових характеристик у рослин і тварин або для покращення існуючих характеристик. Коли більше генів клонується, кількість можливих застосувань збільшується в експоненціальному масштабі.
Приклади клонування ДНК для дослідження
Молекули ДНК складають невелику частку матеріалу в живій клітині, і важко виділити впливи багатьох генів. Методи клонування ДНК доставляють велику кількість певної послідовності ДНК для вивчення, і ДНК виробляє білки так само, як це було в початковій клітині. Клонування ДНК дає можливість вивчити цю операцію для різних генів ізольовано.
Типові дослідження та застосування ДНК-технологій включають вивчення:
Коли більше ДНК-послідовностей клоновано, легше знайти та клонувати додаткові послідовності. Існуючі клоновані сегменти ДНК можна використовувати, щоб визначити, чи відповідає новий сегмент старому та які частини відрізняються. Потім ідентифікація цільової послідовності ДНК швидша та точніша.
Приклади клонування ДНК для генної терапії
В генна терапія, клонований ген представлений клітинам організму, природний ген якого пошкоджений. Життєво важливий ген, який виробляє білок, необхідний для певної функції організму, може мутувати, змінювати радіацією або впливати на віруси.
Якщо ген не працює належним чином, важлива речовина відсутня в клітині. Генна терапія намагається зробити замініть ген на клоновану версію, яка дасть необхідну речовину.
Генна терапія досі експериментальна, і мало пацієнтів вилікували за допомогою цієї методики. Проблеми полягають у визначенні одного гена, відповідального за медичний стан, і доставлення багатьох копій гена до потрібних клітин. Оскільки клонування ДНК набуло все більшого поширення, генна терапія застосовується в декількох конкретних ситуаціях.
Останні успішні програми включали:
Генна терапія є одним із найперспективніших застосувань клонування ДНК, але інші нові можливості, ймовірно, розмножуватимуться, оскільки вивчається більше послідовностей ДНК та визначається їх функція. Клонування ДНК доставляє сировину для генної інженерії у необхідній кількості.
Коли роль генів відома і їх належна функція може бути забезпечена шляхом заміни дефектних генів, багато хронічні захворювання і навіть рак можна атакувати і лікувати на генетичному рівні за допомогою технології ДНК.
Пов'язаний вміст: