Зміст
Кількісно визначте свій зразок РНК, вимірюючи його поглинання ультрафіолетового світла (УФ). Нано-краплинний спектрофотометр використовуватиме лише один-два мікролітри вашого зразка, які ви зможете відновити. Інші спектрофотометри потребують значно більшого зразка. Коефіцієнт вимирання нуклеотидів при ультрафіолетовій довжині хвилі 260 нм на 1-сантиметровому шляху світла дорівнює 20. Виходячи з цього коефіцієнта вимирання, абсорбція РНК 40 мкг / мл в тих самих умовах дорівнює одиниці. Використовуючи цю інформацію, ви можете обчислити концентрацію зразка РНК.
Зробіть при необхідності розведення зразка. Стандартне розведення мікрокувети - 1:40. Зробіть це розведення, додавши пробу РНК 2 мкл в стерильну воду 78 мкл.
Дотримуйтесь протоколів вашого конкретного спектрофотометра для калібрування машини за допомогою бланка, а потім визначте оптичну щільність вашого зразка при УФ-довжині хвилі 260 нм.
Помножте поглинання вашого зразка на коефіцієнт розведення на 40 мкг РНК / мл. Рівнянням було б: "Концентрація РНК (мкг / мл) = (OD260) х (коефіцієнт розведення) х (40 мкг РНК / мл) / (1 одиниця OD260)" (Hofstra.edu) Наприклад: Якщо ви розбавили зразок на 1:40, а показник поглинання становив 0,08, ви помножили 0,08 х 40 х 40 = 128 мкг / мл = 0,13 мкг / мкл
З'ясуйте чистоту вашого зразка, взявши ще одне зчитування поглинання при довжині хвилі ультрафіолетового діапазону 280 нм. Співвідношення OD 260 / OD 280 буде вказувати, чи - і на якому рівні - ваш зразок забруднений білком або фенолом. Результат від 1,8 до 2,0 вказує на якість РНК.