Зміст
- Електрофорез має обмежений аналіз вибірки
- Вимірювання електрофорезом не точні
- Необхідний істотний початковий зразок
- Візуалізувати можна лише певні молекули
- Електрофорез - низька пропускна здатність
Гель-електрофорез - це техніка, при якій біологічні молекули відокремлюються одна від одної та ідентифікуються в біологічних дослідженнях або медичній діагностиці. Починаючи з свого розвитку в 1970-х роках, ці методи були неоціненими при виявленні генів (ДНК) та генних продуктів (РНК та білка), що цікавлять дослідження. В останні роки з’явилися новіші методи, які надають більшої специфіки та деталізації щодо того, що відбувається в живих системах. Хоча ці методи не витісняють електрофорез і вдосконалені маніпуляції можуть розширити життєздатність методики, важливо усвідомити, що гель-електрофорез може, а що не може зробити.
Електрофорез має обмежений аналіз вибірки
Електрофорез специфічний для будь-якої тканини, яку ви взяли. Наприклад, якщо ви проводите південну пляму (тип електрофорезу) на щоці, ви дивитесь на гени з епітеліальних клітин вашої щоки і ніде більше у вашому тілі. Часом це може бути корисним, але дослідники часто цікавляться більш широкими ефектами.
Такі методи, як in situ гібридизація (ISH), можуть взяти ділянку тканини та проаналізувати експресію генів на кожній невеликій ділянці цього зразка.Таким чином, дослідники можуть розглядати кожну область мозку у зразку з ISH, тоді як методи електрофорезу можуть розглядати лише декілька областей одночасно.
Вимірювання електрофорезом не точні
Гель-електрофорез може ефективно відокремлювати подібні білки з різною вагою (це методика, яку називають вестерн-блоттінгом). Він може відокремити їх точніше за допомогою методики, відомої як 2d електрофорез; це поширене в протеоміці.
На жаль, всі вимірювання, проведені за допомогою цієї методики, в кращому випадку напівкількісні. Для отримання точної маси (ваги) білків слід застосовувати мас-спектроскопію після очищення білка за допомогою електрофорезу. Крім того, порівняння відносної кількості різних молекул залежить від щільності смуги (темряви) різних плям на гелі. Цей метод має певну ступінь помилок, і зразки зазвичай виконуються кілька разів, щоб отримати чисті результати.
Необхідний істотний початковий зразок
Електрофорез - це техніка виділення та візуальної ідентифікації різних біомолекул. Це робиться шляхом пропускання електричного струму через гель для відділення заряджених молекул різної ваги. Якщо молекула, яку ви цікавите, чи не досить поширена, її смугу буде практично непомітною і важко виміряти.
ДНК і РНК можуть дещо ампліфікуватися перед проведенням електрофорезу, але це не практично робити з білками. Тому для проведення цих аналізів потрібна велика проба тканини. Це може обмежити корисність методики, особливо в медичному аналізі. Практично неможливо запустити електрофорез на зразки з однієї клітини; проточна цитометрія та імуногістохімія частіше застосовуються для оцінки клітинної експресії білків. Метод під назвою ПЛР відмінний для точного вимірювання мініатюрних кількостей РНК.
Візуалізувати можна лише певні молекули
Електрофорез чудовий при розділенні та ідентифікації біомолекул середнього та великого розміру. Однак багато молекул, які дослідники хочуть подивитися, є меншими; малі гормони, нейромедіатори та іони не можуть бути виміряні електрофорезом. Це з двох причин: вони не реагують належним чином з препаратом електрофорезу (як правило, це техніка, яка називається SDS PAGE), і навіть якщо вони це зробили, вони занадто малі, щоб належним чином відокремитись і вибігали б на дно гелю. Натомість ці молекули вимірюються такими методами, як RIAA (радіоімунологічний аналіз) та ІФА (аналіз на імуноферментацію, пов'язаний з ферментами).
Електрофорез - низька пропускна здатність
Гель-електрофорез, як правило, з низькою пропускною здатністю, це означає, що він не дає даних особливо швидко. Контрастний електрофорез, де ви можете одночасно переглянути невелику кількість молекул РНК, за допомогою ПЛР (ланцюгової реакції полімерази), яка дозволяє одночасно оцінювати тисячі зразків. Аналогічно, проточна цитометрія може проводити вимірювання тисяч індивідуальних клітин і здійснювати складні кореляції, в той час як електрофорез розглядає клітини масово і не може робити таких тонких розрізнень. ПЛР та проточна цитометрія представляють масово паралельні та серійні процеси відповідно, і вони значно випереджають здатності електрофорезу генерувати дані досліджень.