Зміст
- Що таке гель-електрофорез?
- Компоненти електрофорезу
- Ліплення гелю
- Як працює електрофорез?
- Заряд і розмір Визначте смуги ДНК
- Застосування та використання електрофорезу
Гель-електрофорез, який часто називають ДНК-електрофорезом або просто електрофорезом, - це техніка, яка використовується для розділення фрагментів ДНК (та інших заряджених молекул) відповідно до розміру. Зазвичай це робиться за допомогою агарозного гелю та електричного заряду, щоб відокремити фрагменти один від одного.
Ця методика має декілька застосувань, включаючи вивчення ДНК, перебір ДНК, кримінологію та різні медичні програми.
Що таке гель-електрофорез?
Гель-електрофорез - це методика, яка дозволяє вченим розділяти заряджені молекули відповідно до розміру. Сюди входить ДНК, РНК та білки.
Пам'ятайте, що ДНК і РНК мають незначний негативний заряд завдяки негативно зарядженим молекулам кисню в цукро-фосфатній магістралі молекули. Білки можуть мати діапазон зарядів в залежності від амінокислот всередині поліпептидного ланцюга.
Компоненти електрофорезу
Для проведення електрофорезу спочатку потрібно зробити гель. Це можна зробити майже в будь-якій лабораторії; агарозні гелі найбільш поширені. Для виготовлення гелю порошок агарози змішують зі спеціальним буфером, що називається буфером електрофорезу. Потім цю суміш нагрівають до розчинення агарози і повністю змішують в буферному розчині.
Зауважимо, що деякі протоколи електрофорезу вимагають додавання броміду етидію (Et-Br). Це забарвлює будь-яку ДНК, що використовується в електрофорезі, що дозволяє переглядати положення фрагментів під УФ-світлом.
Ліплення гелю
Потім його виливають у прямокутну форму, що називається лоток для лиття гелю. Поряд із формою, яка створює прямокутний гель, що використовується для електрофорезу, на одному з кінців гелю розміщують гребінець. Цей гребінець робить лунки, куди завантажуються зразки, які ви хочете відокремити за допомогою електрофорезу. Зображення ви можете побачити тут.
Після затвердіння гелю гребінець свердловини видаляється і гель поміщається в спеціальний бак для електрофорезу. Ще один буфер заповнюють в резервуар, поки незначний шар буфера повністю не покриє агарозний гель.
Цей резервуар виробляє електричний струм (від 50 до 150 В) через буферний розчин і, в свою чергу, через агарозний гель. Лунки агарозного гелю розміщуються на негативному кінці струму ( катод) з іншим кінцем гелю на позитивному кінці струму ( анод).
Як працює електрофорез?
Перед тим, як електричний струм пройде через бак і гель, ваші зразки завантажуються в лунки. Це робиться за допомогою мікропіпети. "Маркерний" зразок, також відомий як ДНК-трап, - це зразок з відомими розмірами фрагментів ДНК, який допоможе вам порівняти ваші зразки та зрозуміти розміри випробуваного зразка.
Часто a слідкуючий барвник (також називається завантажувальним барвником) додається до кожного зразка, щоб допомогти завантажувати зразок у лунки. Барвник також допомагає відстежувати рух зразків через гель.
То як зразки насправді рухаються через гель і розділяються за розміром? Це має відношення до електричний струм який проходить через агарозний гель разом з розмір / структура фрагментів і агарозний гель.
Заряд і розмір Визначте смуги ДНК
Пам'ятайте, що в цілому заряд ДНК є негативний . Отже, коли ці зразки поміщаються в лунки, близькі до негативного кінця електричного струму, це призведе до переміщення негативно зарядженої ДНК подалі від катода (негативний заряд) і рухайтеся у напрямку до анода (позитивний заряд) на протилежному кінці.
Крім цього руху зразків, електрофорез також розділяє зразки та фрагменти цих зразків за розмірами. Це відбувається тому менші молекули і фрагменти можуть рухатися швидше і легше через гель більші молекули та фрагменти рухатися повільніше. Це означає, що невеликі фрагменти переміщаться до кінця гелю швидше, ніж більші, і, як результат, відокремлюють кожен фрагмент за розміром.
Після проходження гелю протягом години (у більшості протоколів) заряд вимикається і гель аналізується. У різних точках уздовж гелю ви побачите чітку прямокутну смугу, яку часто називають смугою ДНК або білковою смугою. Кожна смуга являє собою один фрагмент, який перемістився по гелю.
Застосування та використання електрофорезу
У лабораторії є багато застосувань для електрофорезу. Ось лише декілька: