Зміст
Фарбування по Граму - це диференційована процедура фарбування, яка показує, які бактерії є грампозитивними або грамнегативними залежно від їх кольору. Ацетоновий спирт - це один реагент, який використовується в цьому процесі для забезпечення кольорової диференціації. Грампозитивні бактерії мають товстий пептидоглікановий шар і забарвлюють фіолетовий колір, тоді як грамнегативні мікроорганізми мають мало-майже пептидоглікановий шар і плями рожеві.
Первинна пляма-кристал фіалки
Після того, як слайд бактеріальної проби підготовлений, для того, щоб спочатку фарбувати зразок, використовували кристалічну фіалку. У цей момент і грампозитивні, і грамнегативні бактерії виявляться фіолетовими. Зазвичай кристал фіалки наносять на предметне скло на 30 секунд, перш ніж змити зайву пляму водою. Кришталевий фіолетовий колір може трохи прилипати до шарів пептидоглікана, тому не вся первинна пляма буде змиватися водою.
Мордант-Йод
Потім йод додають до проби протягом однієї хвилини. Він виконує функцію морилки, яка служить для фіксації барвників у процесі фарбування. Йод виконує цю функцію, зв'язуючись із кристалом фіалки та створюючи нерозчинний комплекс, який набагато краще прилипає до товстого пептидогліканового шару, що знаходиться у грампозитивних бактеріальних клітинах, ніж лише у кристалічному фіолетовому. Після додавання йоду не відбувається кроку промивання водою.
Деколоризатор-алкоголь
Як знебарвлюючий засіб можна використовувати ацетон або етиловий спирт. Спирт розчиняє ліпіди, що знаходяться у зовнішній клітинній мембрані грамнегативних бактерій, дозволяючи кристалічно-фіолетово-йодному комплексу витікати з тоншого пептидогліканового шару. Спирт додають протягом 10 - 20 секунд; його виливають на предметне скло, поки весь йод не змиється і стік не стане безбарвним. У цей момент у процесі забарвлення по Граму грамнегативні бактерії є безбарвними, тоді як грампозитивні бактерії все ще зберігають кришталевий фіолетовий колір. Після закінчення гірки потрібно сполоснути водою, щоб зупинити ефект знебарвлення.
Контрфорт-Сафранин
Потім додають сафранін для підвищення видимості та контрасту з безбарвними грамотрицательними бактеріями. Пляма робить ці бактерії рожевими під мікроскопом. Оскільки пляма додається до всього зразка, воно також забарвлює грампозитивні бактерії, але чим темніше кришталевий фіолетовий приховує світліший сафраніновий рожевий колір. Після того, як зразок слайда протягом хвилини був залитий сафраніном, воду використовують для змивання зайвої плями, яка не прилипала до бактеріальних клітин.