Зміст
Полімеразна ланцюгова реакція або ПЛР - це техніка, яка фотокопіює один фрагмент ДНК на багато фрагментів - експоненціально багато. Перший крок у ПЛР - це нагрівання ДНК, щоб вона денатурирувалась, або розплавлялася в окремі ланцюги. Структура ДНК схожа на мотузкову драбину, в якій на стрічках є мотузки з магнітними кінцями. Магніти з’єднуються, утворюючи леза, які називаються парами основ, і, таким чином, протистоять їх розбиванню. Кожен фрагмент ДНК плавиться в окремі нитки при різних температурах. Розуміння того, як структура ДНК поєднується в окремих частинах ДНК, дасть зрозуміти, чому різні фрагменти ДНК плавляться при різних температурах і навіщо такі високі температури потрібні в першу чергу.
Тане! Тане!
Першим етапом ПЛР є розплавлення ДНК так, щоб дволанцюгова ДНК розділилася на одноланцюгову ДНК. Для ДНК ссавців цей перший крок, як правило, включає нагрівання приблизно 95 градусів Цельсія (приблизно 200 Фаренгейта). При цій температурі водневі зв’язки між парами A-T і G-C або ланцюгами в драбині ДНК розриваються, розпаковуючи дволанцюжкову ДНК. Однак температура недостатньо гаряча, щоб зламати фосфатно-цукрову основу, яка утворює окремі пасма або полюси сходів. Повне розділення одиночних ниток готує їх до другої стадії ПЛР, яка охолоджує, щоб дозволити короткі фрагменти ДНК, звані праймерами, зв'язувати окремі ланцюги.
Магнітні блискавки
Однією з причин нагрівання ДНК до високої температури 95 градусів Цельсія є те, що чим довше подвійний ланцюг ДНК, тим більше вона хоче залишатися разом. Довжина ДНК - це один із факторів, що впливає на температуру плавлення, обрану для ПЛР на цьому фрагменті ДНК. Пари бази A-T і G-C у дволанцюжковій зв'язці ДНК між собою, щоб утримувати дволанцюжкову структуру разом. Чим більше послідовних пар основ між двома односмуговими зв’язками, тим більше їх сусідів також хоче зв'язати, і тим сильнішим стає привабливість між двома нитками. Це як блискавка, виготовлена з маленьких магнітів. Коли ви закриєте блискавку, магніти, природно, захочуть застебнути і залишитися на блискавці.
Сильніші магніти приклеюються більш щільно
Інший фактор, який впливає на температуру плавлення, яку слід обрати для цікавить Вас фрагмента ДНК, - кількість пар основ G-C, присутніх у цьому фрагменті. Кожна пара баз схожа на два міні-магніти, які приваблюють. Пара з G і C набагато сильніше приваблює, ніж пара A і T. Таким чином, шматочок ДНК, який має більше пар G-C, ніж інший фрагмент, потребує більш високої температури перед плавленням в окремі ланцюги. ДНК природно поглинає ультрафіолетове світло - на довжині хвилі 260 нанометрів, якщо бути точним - і одноланцюгова ДНК поглинає більше світла, ніж дволанцюгова ДНК. Таким чином, вимірювання кількості поглиненого світла - це спосіб вимірювання того, наскільки ваша дволанцюгова ДНК розплавилася в окремі ланцюги. Ефект "магнітної блискавки" пар G-C та A-T базується на тому, що графік світлопоглинання дволанцюжкової ДНК, побудованої проти підвищення температури, має сигмоподібну форму, має форму S, а не пряму лінію. Крива S являє собою опір роботи в команді, які пари підстав надають проти тепла, оскільки вони не хочуть відокремлюватися.
Точка на півдорозі
Температуру, при якій довжина ДНК плавиться в одиночні нитки, називають її температурою плавлення, що позначається абревіатурою «Тм». Це означає температуру, при якій половина ДНК у розчині розплавилася в окремі ланцюги, а друга половина - ще в подвійній формі. Температура плавлення різна для кожного фрагмента ДНК. ДНК ссавців має вміст G-C 40%, тобто решта 60% пар основ - As і Ts. Його вміст 40% G-C викликає плавлення ДНК ссавців при 87 градусах Цельсія (близько 189 Фаренгейта). Ось чому перший крок ПЛР на ДНК ссавців - це нагрівання її до 94 градусів Цельсія (201 Фаренгейта). Всього на сім градусів спекотніше температура плавлення, і всі подвійні пасма повністю розплавляться до одиночних ниток.