Зміст
У хімічних реакціях, що каталізуються ферментом, фермент знижує кількість енергії активації, необхідну тимчасовим зв'язуванням із субстратом і перекручуванням його в напружений стан. K (каталізатор) або "kcat" для реакції відноситься до концентрації, незалежної від концентрації, для швидкості, з якою конкретний фермент може перетворити субстрат в молекулу продукту. Для обчислення ккату вчені спочатку змішують кілька пробірки з різними концентраціями субстрату (відомий як "ферментативний аналіз") і випробовують їх через постійні інтервали часу за допомогою світлового спектрофотометра для вимірювання зростаючих концентрацій молекул продукту. Потім ці дані будуються на графіку та аналізуються.
Обчислення початкових швидкостей
Складіть графік концентрації продукту порівняно з часом для даних з першої пробірки для ферментативного аналізу. Примітка: горизонтальна вісь повинна бути "час", а вертикальна - "концентрація продукту".
Обчисліть лінію лінійної регресії для точок даних, які ви накреслили у розділі 1, крок 1. Хоча калькулятори Excel та графіки можуть легко визначити цю лінійну модель, ви можете отримати оцінку нахилу ліній регресії, поділивши різницю в концентрації продукту між суміжними даними бали за їх різницею у часі.
Запишіть нахил лінії лінійної регресії з розділу 1, крок 2 як "початкову швидкість реакції (Vo)". Примітка: у моделі регресійної лінії "= m + b" коефіцієнт "m" - це нахил.
Повторіть кроки 1, 2 і 3 для решти пробірок в аналізі.
Обчислення Vmax
Накресліть зворотну концентрацію субстрату для кожної пробірки проти зворотної її початкової швидкості реакції (з розділу 1, крок 4). Наприклад, якщо початкова швидкість для пробірки з початковою концентрацією субстрату 50 мкмоль (мкм) становила 80 мкм / с, обертання становитиме 1/50 мкм для концентрації субстрату і 1/80 мкм / с для початкової швидкість. Примітка: зворотна концентрація підкладки повинна бути на горизонтальній осі, а зворотна початкова швидкість - на вертикальній осі.
Примітка: концентрація субстрату повинна бути на горизонтальній осі, а початкова швидкість реакції повинна бути на вертикальній осі.
Визначте лінійну лінію регресії для діаграми, яку ви накреслили у розділі 2, крок 1. Примітка. Оскільки вам потрібно знати y-перетин для лінії регресії, вам слід ввести точки з розділу 2, крок 1 в Excel або a графічний калькулятор та використовувати вбудовану функцію регресійного моделювання.
Ділимо 1 на y-перетин від лінійної лінії регресії. Це дасть вам значення оберненої Vmax, максимальну швидкість реакції для ферменту. Примітка: якщо модель лінійної регресії приймає вигляд "= m + b", то значення "b" було б y-перетином. Розділіть 1 на "b", щоб обчислити обернену Vmax.
Розділіть 1 за результатом з розділу 2, крок 3 для обчислення фактичного значення Vmax.
Визначте концентрацію ферменту в початковому аналізі (див. Вихідні дані). Примітка: концентрація ферменту однакова для всіх пробірок; тільки концентрація субстрату змінюється в аналізі.
Розділіть Vmax (з розділу 2, крок 4) на концентрацію ферменту (з розділу 2, крок 5). Результат - значення Kcat.